检测反转录有没有成功

检测反转录成功的关键在于观察目标基因的扩增情况。通过设计特异性引物进行PCR反应，若能在预期大小处观察到清晰条带，说明反转录已完成。凝胶电泳结果中，目标条带的亮度与模板量成正比，明亮且特异的条带代表成功的cDNA合成。内参基因如GAPDH或ACTB的稳定表达也能验证实验质量，这些管家基因在几乎所有细胞中都有稳定转录，可作为阳性对照。

反转录效率可通过实时荧光定量PCR(qPCR)评估。比较基因组DNA和cDNA的Ct值差异，理想情况下cDNA的Ct值应显著低于基因组DNA。使用标准曲线法计算起始模板量，成功反转录的样本会呈现良好的线性关系。添加外源性RNA对照物，如SP6 RNA聚合酶转录的RNA，能直接反映反转录效率。这些方法共同确保实验结果的可靠性，排除假阴性可能。